肺炎链球菌的微生物学检验方法与原理

肺炎链球菌的微生物学检验方法与原理

余春萍

自贡市荣县中医院 ,四川 自贡 ,643100

肺炎链球菌（Setrt Pococcuspneumoinae）简称肺炎球菌，是1881年首次由巴斯德及G.M.Stembegr分别在法国和美国分离出来。肺炎球菌菌体似矛头，呈短链状排列或成双排列的球菌，革兰氏阳性，绝大多数兼性厌氧，偶有专性厌氧，肺炎链球菌的主要致病物质是肺炎球菌溶血素和荚膜。近年来，越来越多的国家和地区出现耐药性肺炎链球菌菌株的报道，严重威胁着肺链感染的临床治疗，已成为一个呛待解决的健康问题。

1、药敏试验

1.1微量稀释法该法是美国临床实验室标准化委员会（NCCLS）推荐的肺炎链球菌药敏试验的参考方法。该法主要使用经过离子校正的M-H肉汤+2%～5%的溶血马血作为培养基的，然后将抗生素稀释后加人培养基中。将在羊血平板上的菌落制备菌液，以0.5浊度分装微量板。在35℃普通条件下培养24h后，人工判断结果。具体MIC见NCCLS的判定标准。

1.2纸片扩散法NCCLS推荐使用的纸片法药敏试验，主要使用羊血平板，以0.5浊度的菌液接种平板。对于临床分离株的药敏试验，CO2是必备的环境。平板应于35℃条件下在5%的CO2中培养24h后进行测量，从正面量取。抑菌环的大小和质控标准详见NCCLS的规定。纸片扩散法的优点是简单方便，对非β-内酞胺药物的重复性、准确性均较高，但是在应用于青霉素和头抱类抗生素时准确性明显降低。

2、肺炎链球菌的耐药性检验

目前有很多实验室在对血液、脑脊液等体液分离得到的肺炎链球菌耐药性测定时，只检测青霉素的耐药性。事实证明，多重耐药和对三代头抱耐药的肺炎链球菌越来越多，因此，NCCLS已经明确要求，从脑膜炎者分离出来的肺炎链球菌必须做青霉素、头孢曲松或者头孢他啶的MIC，另外还应检测对万古霉素的耐药性。对于中枢神经系统以外分离而来的肺链球菌，则首先应该选用苯唑西林来检测其是否对β-内酰胺类药物耐药。若抑菌环>200mm，证明其对青霉素和β-内酞胺类药物敏感物耐药性；若抑菌环

3、微生物学检查

3.1标本根据感染部位不同采取不同标本，如痰液、脓液、血液、脑脊液等。

3.2直接涂片镜检对痰、脓或脑脊液沉淀物标本，可涂片进行革兰染色镜检，若发现典型的成双排列、有荚膜的革兰阳性球菌，结合临床症状可做初步诊断。

3.3分离培养与鉴定将痰或脓液直接接种于血琼脂平板上，37℃孵育24h后，挑选溶血的可疑菌落做进一步鉴定。血液及脑脊液先在血清肉汤培养基中增菌后，接种到血琼脂平板上分离培养并鉴定。

3.4肺炎链球菌的鉴定主要应与甲型溶血性链球菌鉴别。其中以胆汁溶菌试验、菊糖发酵和奥普托辛试验最为常用。必要时可做小鼠毒力试验。在上述试验中，肺炎链球菌均为阳性，而甲型溶血性链球菌为阴性。

4、肺炎链球菌型别鉴定

4.1荚膜肿胀试验亦称为Quellug试验。新鲜标本悬液与等量不稀释的肺炎球菌分型诊断血清混合后，覆以盖玻片，油镜下观察。标本中肺炎球菌若与同型免疫血清相遇，荚膜将显著增大。

4.2凝集试验将可疑肺炎球菌与已知标准分型血清做玻片凝集试验，若细菌凝集成堆，为同型肺炎球菌。

5、分子流行病学研究方法

近年来，由于传统的细菌药敏试验和英膜血清学分型具有一定的局限性，分子流行病学研究方法被作为一种重要的补充手段用于肺炎链球菌感染和耐药性的分析中。主要包括以下三个方面，①BOX-PCRP：它是肺炎链球菌染色体上的一段重复序列，呈现高度保守性，由三个亚单位组成，分别为A、B、C。其中以BOXA1为引物的PCR检测法被广泛应用。②核酸分子杂交：该技术又被称为核糖体分型。首先利用限制性内切酶切割DNA，电泳后将DNA1转移到尼龙膜上，使其与被标记的BOX片段进行杂交，从而比较DNA片段的同源性。③限制性片段长度多态性分析（RFLP）：该法与上法有类似之处，首先利用限制性内切酶切割DNA，经电泳分离后，直接比较各菌株的DNA指纹，从而判断其同源性。